[세포생물학] 현미경의 종류(4) - 전자현미경, 샘플 염색 방법

광학현미경은 해상력에 제한이 있으므로 세포 구조를 상세히 관찰하기 위해서는 해상력이 높은 전자현미경 (Electron microscope)이 필수적이다. 전자현미경은 1930년대에 최초로 개발된 후 생물학 시료에 처음으로 사용되었다.

 

COVID-19 virus을 전자현미경으로 촬영한 모습. [출처] PI electron microscopy, Nonmagnetic and vacuum-compatible actuators positioning systems

 

전자현미경 (Electron microscope)

전자는 빛 보다 짧은 파장을 가진다. 그렇기 때문에 광학현미경과 비교하여 훨씬 큰 해상도를 가지는 것이 특징적이다. 전자의 파장은 약 0.04 nm로 가시광선 파장보다 10 만 배  짧다. 이 파장의 전자빔으로 가능한 이론적 해상도는 0.002 nm이지만 해상도를 결정하는 한계 요인이다. 전자현미경에서 사용하는 전자기렌즈는 개구 각도가 0.5 도 밖에 되지 않으므로 개구수는 0.01이며 최적 조건에서 전자현미경의 해상도는 약 0.2 nm이다. 더구나 생물시료의 경우 대비가 매우 작으므로 실제 가능한 전자현미경의 해상도는 1-2 nm이다. 이는 파장값으로 예측 가능한 해상도보다 매우 낮은 수준이지만 광학현미경의 100 배가 넘는 해상도를 보인다.

 

전자현미경의 종류

1. 투과전자현미경 (Transmission electron microscopy) 

전자현미경은 투과전자현미경과 주사전자현미경 2 종류가 있다. 투과전자현미경은 명시야광학현미경과 유사하게 세포를 염색한 후 관찰한다. 시료를 고정한 후 전자 산란에 의한 대비가 나타나도록 중금속염으로 염색한다. 시료를 투과한 전자빔은 형광판에 상을 나타낸다. 그러나 전자빔이 시료를 투과할 때 중금속과 충돌하며 산란되므로 세포에서 중금속으로 염색된 부분은 검게 나타난다. 투과전자현미경으로 관찰하고자 하는 시료는 양성염색 또는 음성염색으로 염색해야 한다.

 

염색방법- 양성염색법

양성염색은 조직을 얇게 자른 후에 세포 구성성분인 지질, 단백질 및 핵산에 반응성을 띄는 중금속염 (osmium, tetroxide, uranyl acetate, lead citrate)으로 염색하는 방법을 말한다. 중금속염은 세포 구조물과 결합하여 최종 이미지에서 검은 상으로 나타난다. 또 다른 양성염색 방법으로 특정 고분자를 염색하는 방법이 있다. 예를 들면 세포 속 특정 단백질과 결합하는 항체를 금 입자로 두른 후 (표지한 후) 세포를 염색하면 그 단백질의 세포 내 분포를 알아볼 수 있다. 이 방법은 형광현미경에서 형광으로 표지 된 항체를 사용하는 것과 유사하다. 전자단층촬영법을 사용하면 해상도 2-10 nm급의 3차원 이미지를 얻을 수 있는데, 이는 여러 장의 연속적인 2차원 이미지를 컴퓨터에서 합성한 것이다.

 

염색방법-음성염색법

음성염색은 생물학적 구조를 관찰하는데 주로 사용된다. 임의로 분리해 준 세포 소기관이나 세균, 고분자화합물 등이 이에 속한다. 이 방법에서는 시료를 필름에 부착하고 중금속 이온으로 시료 표면과 시료 주위를 염색하는 것이 핵심이다. 시료는 염색되지 않고 시료 주위는 중금속 필름 때문에 둘러져서 염색이 되는데, 이를 전자현미경으로 관찰하면 시료 부분은 밝게 주변은 어둡게 보이게 된다.

 

금속음영법

금속 음영법은 투과전자현미경으로 생물학적 구조를 관찰하는 또 다른 방법이다. 백금과 같은 중금속을 기화시켜 시료를 얇게 코팅한다. 중금속이 기화되면, 기화되는 방향 쪽 시료면은 다른 면보다 더 두껍게 코팅되게 된다. 코팅된 금속의 두께차이가 그림자처럼 보이게 되며, 3차원적인 전자현미경 상을 얻을 수 있다.

 

동결파쇄법

앞서 소개한 금속음영법과 함께 막구조 연구에 사용되는 방법이다. 시료를 액체질소에서 얼린 후 칼날로 파쇄한다. 이러면 지질이중층 가운데가 분리되어 막의 내부가 나타나게 된다. 시료를 백금으로 음영시킨 후 산으로 시료 부분을 녹여 없애면 시료 표면을 따라 흘러내린 금속 복제품이 만들어진다. 이렇게 준비된 금속 복제품을 전자현미경으로 관찰하면 표면에 융기 모양을 관찰할 수 있는데, 이는 지질 이중층에 박혀있던 단백질을 나타내는 것이다. 동결 파쇄를 변형시킨 방법인 동결부식을 사용하면 세포막의 바깥면도 관찰할 수 있다.

 

2. 주사전자현미경

주사전자현미경으로 세포의 3차원적인 상을 관찰할 수 있다. 주사전자 현미경에서는 전자빔이 시료를 투과하지 않고 중금속으로 코팅된 시료 겉 부분을 스캔하는 방법을 사용하는 것이 특징적이다. 이때 시료 겉 부분에서 산란되거나 반사되는 전자들로  3차원 영상을 만든다. 주사전자현미경의 해상도는 10nm 밖에 되지 않으므로 세포소기관이나 생체 내 고분자보다는 세포 전체 모습을 관찰하는 데 사용된다.