[세포생물학] 현미경의 종류(2) - 형광현미경, GFP, FREP, FRET

세포의 특정 유전자, RNA 전사물을 상보적인 서열을 가진 탐침(probe)을 사용하여 관찰할 수 있다. 이때 탐침자에는 방사선동위원소나 형광색소가 부착되어 있다. 세포 내 단백질은 항체를 사용하여 관찰할 수 있다. 핵산 탐침 또는 항체에 광학현미경으로 관찰이 가능하도록 표지자를 부착하여 세포 내에서 분자의 위치를 알아낼 수 있다. 

 

 

Green Fluorescence protein excitation/emission 값 (회색 - Excitation 파장, 초록 - Emission 파장). [출처] In Vivo Fluorescence Imaging with GFP and RFP, 2020, News-Medical.net published article.

 

형광현미경 (Fluorescence microscope)

세포 내 분자들의 위치를 연구하는 매우 민감한 방법으로 연구에 널리 사용된다. 고정된 세포와 살아있는 세포 모두 형광색소를 사용하여 특정 분자를 표지 할 수 있다. 형광색소는 어떤 특정 파장의 빛을 받은 후 다른 파장의 빛을 방출하는 분자이다. 방출하는 파장의 빛을 이에 맞는 필터를 사용하여 검출할 수 있다. 이를 특정 파장대에서 Exitation/Emission 되는 것이라 이야기한다. 예를 들어, Alex 488 형광색소의 excitation 파장은 490 nm이고, emission 파장이 520nm라 하자. 490 nm 파장대의 레이저를 쏘아주면 520nm의 파장을 띄는 색소가 방출되는 원리이다. 형광색소를 가지고 가장 많이 사용되는 연구방법은 특정 단백질에 대한 항체를 형광색소로 표지하여 그 단백질의 세포 내 분포를 알아내는 것이다. 

 

형광표지, GFP

형광현미경을 이용한 연구방법에서 가장 획기적인 진전은 해파리에서 유래한 녹색형광단백질 (GFP, Green fluorescent protein)을 이용하여 살아 있는 세포에서 단백질을 관찰하는 실험방법이 개발된 것이다. GFP 유전자는 DNA 재조합 기술을 이용해 원하는 단백질 분자의 유전자를 부착시킬 수 있다. GFP로 표지 된 단백질을 세포에서 발현시킨 후 형광현미경으로 관찰하면 세포를 고정하거나 형광표지 된 상체를 사용할 필요 없이 살아 있는 세포에서 단백질의 발현을 추적할 수 있다. GFP는 응용성이 넓어서 이제 세포생물학에 널리 사용되고 있으며 살아 있는 세포에서 다양한 단백질의 분포를 연구하는 데 사용되고 있다. GFP는 청색, 황색, 적색 파장이 모두 가능하므로 여러 종류의 단백질들을 가각 다른 파장의 GFP로 염색한 후 동시에 이들 단백질들을 하나의 세포에서 관찰하는 것이 가능하다.

 

FREP (Fluorescence recovery after photobleaching)/ FRET (Fluorescence resonance energy transfer)

살아 있는 세포에서  GFP로 표지 된 단백질의 이동과 상호작용을 알아볼 수 있는 다양한 실험기법을 소개하고자 한다. 그중 하나로 광탈색 후형광회복(FREP)을 들 수 있다. GFP 표지 단백질을 세포에 발현시킨 후 세포의 특정 지역을 레이저로 조사한다. 이를 탈색시킨다고 한다. 시간이 지나면 탈색되지 않은 GFP 표지 단백질이 탈색된 세포 지역으로 이동하여 그 부분의 형광이 회복되는 것을 관찰할 수 있는데, 이를 이용하여 세포 내에서 그 단백질의 이동속도를 측정할 수 있다. 세포 내에서 두 단백질이 서로 결합하는 현상은 형광공명에너지 전달법 (FRET)으로 측정가능하다. FRET 실험 진행 시 측정하고자 하는 두 단백질을 서로 다른 종류의  GFP1과 GFP2 변이체 형광색소로 표지 한다. 이때 GFP1에서 나온 형광이 GFP2를 흥분시켜 특정 파장의 형광을 발생시킬 수 있도록 디자인한다. 세포에  GFP1을 흥분시키는 빛을 조사하였는데, GFP2에서 형광이 발생하였다면 두 단백질이 상호작용하여 가까이 존재한다는 것을 나타낸다.